Allium cepa y Allium sativum: Inhibición de E. coli y Salmonella

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
EFECTO INHIBITORIO DE ALLIUM CEPA Y ALLIUM
SATIVUM SOBRE CEPAS DE Escherichia coli Y
Salmonella enteritidis
TRABAJO RECEPCIONAL EN LA MODALIDAD DE:
TESIS
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
PRESENTA:
MARÍA ANTONIA SÁNCHEZ AGUILAR
ASESORES:
MVZ. Mc. ALFREDO ARROYO LARA
MVZ. AMALIO ALONSO BUSTAMANTE
VERACRUZ, VER.
ENERO 2013
ÍNDICE GENERAL
Página
ÍNDICE DE CUADROS
iii
ÍNDICE DE FIGUR AS
iv
DEDICATORIAS
v
AGRADECIMIENTOS
vi
RESUMEN
vii
1.
INTRODUCCIÓN
1
2.
ANTECEDENTES
3
3.
JUSTIFICACIÓN
15
4.
HIPÓTESIS
17
5.
OBJETIVO GENERAL
17
6.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
17
7. MATERIAL Y MÉTODOS
18
7.1 LOCALIZACIÓN
18
7.2 MATERIAL BIOLÓGICO:
18
7.3 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN PARA LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA
18
7.4 INGREDIENTES FRESCOS
19
i
7.5 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN PARA DETERMINACIÓN DE
PORCENTAJE DE ELIMINACIÓN
20
7.6 ESTANDARIZACIÓN DE LA MUESTRA
21
8.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
23
9.
CONCLUSIONES
41
10. LITERATURA CITADA
42
ii
ÍNDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia coli a una
suspensión de cebolla (Allium cepa) blanca al 10%
33
Cuadro 2. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia coli a una
suspensión de cebolla (Allium cepa) morada al 10%
33
Cuadro 3. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia coli a una
suspensión de cebolla (Allium cepa) cambray al 10%
34
Cuadro 4. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia coli a una
suspensión de ajo (Allium sativum) al 10%
35
Cuadro 5.- CMI del ajo necesaria contra las bacterias de la investigación
36
Cuadro 6. Relación de UFC observadas en las placas de Escherichia coli y
Salmonella enteritidis, después de realizar la técnica para la tasa (%) de
eliminación
39
Cuadro 7.- Tasa (%) de eliminación de los extractos de ajo y cebolla sobre las
bacterias de Escherichia coli y Salmonella enteritidis
40
iii
ÍNDICE DE FIGUR AS
Página
Figura 1. Compuestos sulfurados del ajo (Ganado, 2001)
8
Figura 2. Suspensiones de ajo deshidratado.
22
Figura 3. Absorbancia en nm del ajo deshidratado filtrado el mismo día
23
Figura 4: Absorbancia en nm del ajo deshidratado filtrado a las 24 horas
24
Figura 5. Absorbancia en nm del ajo deshidratado filtrado a las 48 horas
24
Figura 6. Absorbancia en nm de la cebolla deshidratada leída mismo día
25
Figura 7. Absorbancia en nm de la cebolla deshidratada leída a las 24 horas
26
Figura 8. Absorbancia en nm de la cebolla deshidratada leída a las 48 horas
26
Figura 9. Absorbancia en nm del ajo fresco filtrado mismo día
27
Figura 10. Absorbancia en nm del Ajo fresco filtrado 24 horas
28
Figura 11. Absorbancia en nm del Ajo fresco filtrado 48 horas
28
Figura 12. Absorbancia en nm de la Cebolla fresca filtrada el mismo día
29
Figura 13. Absorbancia en nm de la cebolla fresca filtrada a las 24 horas
30
Figura 14. Absorbancia en nm de la Cebolla fresca filtrada a las 48 horas
30
Figura 15. Pozos de una microplaca utilizada para observar la CMI, la cual fue
determinada mediante la presencia o ausencia de turbidez
32
Figura 16. Control positivo de diluciones seriadas del uno al tres, donde puede
observarse crecimiento de cepas de Escherichia coli en Agar McConkey
37
Figura 17. Control positivo de diluciones seriadas del uno al tres donde puede
observarse crecimiento de colonias de Salmonella enteritidis en Agar Verde
Brillante
37
iv
DEDICATORIAS
A mis padres:
Jaime Sánchez Gutiérrez
Leonor Aguilar Betanzos
Porque gracias a su guía y apoyo incondicional he logrado completar esta nueva
etapa. Los quiero demasiado, a ustedes les debo la vida y espero algún día
recompensarles todo el esfuerzo y la confianza que depositaron en mí.
A mi hermana:
Gabriela Abigail Sánchez Aguilar
Por las veces en que me brindó apoyo y por haberme dado la oportunidad de
conocer a mi sobrina, la pequeña Atzin, que llegó a darle otra visión a la vida.
A mi abuela:
Celia Betanzos López
Por ser una mujer admirable de gran entereza, gracias por el cariño brindado en
cada momento de mi vida. Eres un ejemplo a seguir.
A mi tutora:
MVZ. Rosa María Cordero Pulido
Por ser como una madre durante mi carrera. Agradezco su comprensión y apoyo
en los momentos en que más los requerí.
A mis queridos amigos:
Por ser como mis hermanos. Gracias por los momentos gratos que viví al lado de
ustedes, siempre supieron animarme y apoyarme en los momentos en que más
los necesité.
v
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Veracruzana, por ser una gran institución, formadora de
grandes profesionistas.
Al Laboratorio Cordobés de Diagnóstico Pecuario, por abrirme las puertas y
permitirme realizar este trabajo. Agradezco a su personal, quienes siempre
mostraron gran preparación y me brindaron amistad y confianza durante mi
estancia ahí. Gracias a todos por su apoyo y enseñanzas.
A mis asesores:
MVZ. Mc. Alfredo Arroyo Lara
MVZ Amalio Alonso Bustamante
Por su apoyo, guía y enseñanzas para la realización de esta tesis. Les estaré
eternamente agradecida.
Al MA. José Alfredo Villagómez Cortés
Por su asesoría y consejos brindados en la elaboración de este trabajo.
A mi jurado:
Dr. David I. Martínez Herrera
MC. Luis A. Landin Grandvallet
Dra. Violeta T. Pardío Sedas
Por sus consejos y observaciones para la redacción y corrección de este trabajo.
A Claudia y Sol, por haberme brindado un lugar cuando más lo necesité. Gracias
por permitirme conocerlas y pasar un tiempo junto a ustedes, siempre serán un
ejemplo para salir adelante.
vi
Sánchez Aguilar María Antonia, 2013. Efecto inhibitorio de Allium cepa y Allium
sativum sobre cepas de Escherichia coli y Salmonella enteritidis. Tesis. Facultad
de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. Veracruz,
Veracruz. México
RESUMEN
La herbolaria tradicional tiene una amplia gama de productos que son
utilizados para tratar enfermedades de diversa índole y que son de fácil acceso
para productores de traspatio, quienes muchas veces no cuentan con los recursos
necesarios para aplicar buenas prácticas de bioseguridad. Se ha comprobado que
los principios activos de muchos productos naturales tienen efecto sobre
diferentes tipos de bacterias, es por ello que se realizó un estudio del efecto
inhibitorio que tienen los extractos de Allium cepa (cebolla) y Allium sativum (ajo)
sobre cepas de Escherichia coli y Salmonella enteritidis, las cuales son bacterias
asociadas a trastornos entéricos de muchos animales y que también pueden
afectar al hombre. Mediante un análisis en microplaca se determinó que se
requieren cantidades de por lo menos 12.5 mg/ml de ajo para inhibir el crecimiento
de las bacterias mencionadas. La cebolla no presentó resultados favorables en el
análisis en microplaca, pero mediante la determinación de la tasa porcentual de
eliminación se observó que ejerce un efecto bactericida sobre las bacterias,
concluyendo que se requieren al menos concentraciones mayores al 10% de su
extracto para tener resultados favorables. A dicha concentración, tanto la cebolla
como el ajo demostraron tener un efecto sobre Escherichia coli y Salmonella
enteritidis, por lo que puede utilizarse como una opción de desinfectantes
biodegradables y económicos.
Palabras clave: Escherichia coli, Salmonella enteritidis, inhibición, ajo, cebolla.
vii
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, las producciones pecuarias en general
tienen en claro la
importancia de la bioseguridad para evitar la introducción y diseminación de
enfermedades que pueden derivar en fuertes pérdidas económicas. Dentro de la
bioseguridad se incluyen las prácticas eficaces de desinfección para reducir los
problemas sanitarios y se realiza con productos cuya eficacia ha sido comprobada,
porque es la forma más económica de protección con la que se cuenta (Woodger
y Grezzi, S/F).
Desde la época prehispánica, diversas culturas han hecho uso de los
remedios de origen vegetal para emplearlos como medicamentos y mejorar su
calidad de vida. Existen reportes de que las plantas y sus derivados eran
utilizados en China, Egipto y Babilonia (Oramás y Rodriguez, 1999). De igual
modo, los griegos y romanos comenzaron a hacer uso de las plantas para curar
padecimientos. Por ejemplo, Hipócrates de Cos (460-377 aC) utilizaba vegetales y
algunas sales minerales como medicinas, para después clasificarlas en
purgantes, narcóticos y febrífugos (Barquero, 2007).
Aunque siempre se ha requerido el uso de los antimicrobianos para controlar
las infecciones, el uso indiscriminado de ellos puede derivar en cambios en las
proporciones bacterianas en el individuo que presenta la enfermedad y en el
medio en el que éste se desenvuelve (Ruíz et al., 2001). Los organismos
patógenos que se vuelven resistentes a estas drogas han ido en aumento y por el
1
contrario, el desarrollo de nuevos productos se vuelve más lento debido a los
altos costos y a la velocidad en la que los microorganismos desarrollan la
resistencia (Sussman et al., S/F).
La herbolaria nativa en México aún se utiliza en regiones donde por diversos
motivos no llegan los alcances de la medicina moderna. La pobreza, la poca
seguridad y la falta de profesionales médicos limitan mucho los tratamientos
eficaces (Madaleno, 2007). La naturaleza tiene una amplia gama de productos
vegetales que brinda opciones para cubrir las necesidades básicas para
alimentarnos, vestirnos e incluso, para combatir las enfermedades que aquejan a
la humanidad. El ser humano ha investigado las plantas de su región y así ha
descubierto las capacidades medicinales de muchas de ellas (Anónimo, 1998).
Algunas de las especies pertenecientes a la familia Allium (cebolla, ajo,
cebollines, entre otros) son utilizadas como condimentos, vegetales y plantas
medicinales, aunque el ajo y la cebolla son los más comunes. Los beneficios de
las especies Allium se deben a sus componentes sulfurados. Si la concentración
de éstos es baja, las especies dejan un sabor característico al ser utilizadas en la
preparación de alimentos. Sin embargo, si las concentraciones de sulfuro son
altas, como en el ajo, son usadas
casi siempre como condimentos,
antimicrobianos y para combatir enfermedades. Además de los componentes
sulfurados, también pueden encontrarse otros compuestos como las saponinas y
azúcares como la fructosa, las cuales le dan un característico sabor dulce a
especies Allium, como la cebolla (Keusgen et al., 2006).
2
2. ANTECEDENTES
Por lo general, existe un equilibrio entre los seres vivos y los microbios, lo que
permite que casi todo se encuentre en buen estado de salud, el cual puede llegar
a romperse si los microbios se vuelven gérmenes patógenos capaces de producir
enfermedades (Marcén, 2000).
A pesar de los avances de la medicina, todavía no existen vacunas que
permitan contrarrestar muchas enfermedades de gran importancia en la
producción animal, por lo que las medidas de higiene y desinfección son los
principios básicos de la bioseguridad (Paez y Ocampo, 2005). La desinfección es
el mejor proceso contra la lucha de las enfermedades que se contraen por el
contacto con secreciones u otros materiales portadores de agentes infecciosos.
Consiste en la eliminación de microorganismos con el uso de agentes químicos o
físicos y su campo de estudio atañe tanto al sector humano como a la sanidad
animal, ya que forma parte de programas de Medicina preventiva, planes de
producción animal, transporte y sacrificio de animales, así como de higiene y
producción de alimentos, entre otros (Rodríguez, 2005).
La historia de los antimicrobianos y la desinfección data desde hace muchos
años. En la antigüedad se creía que ciertas sustancias naturales reducían el
contagio de las enfermedades. Su uso se remonta a hace 60,000 años atrás,
desde que los hombres de Neandertal observaban las costumbres de los animales
3
y que por azar descubrieron poco a poco que ciertas plantas les eran beneficiosas
y otras tóxicas (Barquero, 2007).
Hace 4000 años, en Mesopotamia, se utilizaban mezclas de vino, enebro,
ciruelas y se comenzaba a usar el jabón. En el antiguo Egipto, los
embalsamadores utilizaban las sales de natrón y resinas aromáticas como
antisépticos, y la cebolla como bactericida para el tratamiento de sus momias
(Marcén, 2000), además de utilizar vino de palma y vinagre para enjuagar las
cavidades abdominales al momento de embalsamar para que se pudieran
conservar los cuerpos. También empleaban la técnica de filtración en tela para
purificar el jugo de uva (Rodríguez, 2005).
Los chinos, por su parte, usaban el queso de soja enmohecido para
tratamiento de sus heridas y después implementaron la infusión de té verde para
combatir las diarreas (Marcén, 2000). También utilizaban derivados de mercurio y
azufre como desinfectantes y revestimiento protectores (Rodríguez, 2005).
Después, los árabes retoman la práctica del té verde, agregándole hierbabuena
para proveerle de un mejor efecto antimicrobiano. En la India, eran comunes los
vendajes con miel y mantequilla para el tratamiento de heridas, además de que
fermentaban el té verde para obtener el té negro (Marcén, 2000).
Los griegos y romanos también hacen sus primeros aportes en medicina.
Hipócrates hacía uso de la miel y sal para el tratamiento de heridas, así como el
del tomillo y el vinagre como antisépticos; y el vino y canela como antimicrobianos
4
(Marcén,
2000). En el año 429 a.C., se recomendó la fumigación al quemar
maderas y hierbas para alejar a los insectos que por aquel entonces se creía eran
los causantes de las enfermedades. Esta técnica fue utilizada en el combate
contra las epidemias. En el siglo XVII, con el surgimiento de la peste bovina, los
establos se desinfectaban quemando madera de enebro y vapores de vinagre.
Después, se desinfectaban con mezclas de pólvora de cañón, tabaco y plantas
aromáticas (Rodríguez, 2005). Debido a esa necesidad de destruir aquellas
causas de enfermedades y evitar su proliferación, el término “desinfectante” fue
utilizado por primera vez como término médico en el mismo siglo (Paez y Ocampo,
2005).
Durante la Edad Media, el estudio de las propiedades medicinales de las
plantas era realizado por los monjes cristianos (Barquero, 2007). Luego, este tipo
de investigaciones dieron realce a toda Europa. Con la diseminación de las
pestes, se recomendaba limpiar con sosa los lugares que albergaban animales y
el repintado de los mismos con cal viva. Además, las ropas de las personas que
hubieran tenido contacto con los animales infectados debían airarse y someterse a
una exposición a llamas. Si los propietarios se negaban, el castigo eran latigazos y
trabajos forzados (Rodríguez, 2005).
La idea de extraer un compuesto puro de alguna planta para poder utilizarlo
como medicamento surge en 1803, con el aislamiento de los alcaloides por
Friedrich Sertuner. A partir de ahí se desarrollan varias investigaciones a manos
de Pelletier y Caventou (1819), quienes aíslan dos alcaloides de corteza, Merck
5
(1826) obtiene la morfina a partir del opio y en 1831 se consigue la atropina de la
Atropa belladona L. (Barquero, 2007).
Durante el transcurso de la historia, se ha logrado obtener información
valiosa de las propiedades terapéuticas de diversas especies de plantas y, en la
actualidad, se cuenta con técnicas de purificación e identificación de compuestos
químicos, así como de técnicas in vitro que permiten la búsqueda de nuevas
drogas (Barquero, 2007). Sin embargo, el mal uso de éstas tanto en humanos
como en animales, la mala dosificación y el total desconocimiento de la
sensibilidad de los gérmenes característicos a una sola región, ha derivado en el
crecimiento de la resistencia bacteriana que conlleva a graves implicaciones
sociales y pérdidas económicas (Sussman et al., S/F).
Hoy en día, ya no se utilizan muchos de los desinfectantes que eran usados
en el pasado y, debido a la creciente conciencia ecológica, se buscan
desinfectantes con buenos resultados germicidas que no produzcan ningún tipo de
problemas en la salud del hombre y que además sean de bajo impacto ambiental,
razón por la que se ha optado por utilizar desinfectantes biodegradables, muchos
de los cuales son obtenidos de productos naturales (Paez y Ocampo, 2005).
Es por ello que a la par del conocimiento de los fármacos obtenidos de
plantas que se comercializan con la farmacéutica, se sabe de un mercado alterno
que se
dedica a la difusión y venta de hierbas como medicina natural o
suplemento dietético (Barquero, 2007). Aunque el uso de éstas se realiza de forma
6
común en zonas donde no se cuentan con suficientes recursos, la población cada
vez se muestra más interesada en este tipo de terapias alternativas, en especial
para los padecimientos que aún no tienen un tratamiento definitivo (Domingo y
López, 2003).
La sabiduría popular menciona la existencia de diversas sustancias, plantas
y alimentos que poseen propiedades desinfectantes y antisépticas, tales como el
agua, la sal, los alimentos naturales transformados (lácteos, encurtidos, oleáceas,
etc.) y no transformados (ajo, cebolla, puerro, zanahorias, cítricos, entre otros),
condimentos, especias, plantas aromáticas, árboles y arbustos (Marcén, 2000).
Aunque se conoce poco sobre la composición química de las sustancias
antimicrobianas de las plantas y especies, se sabe que las propiedades contra los
microorganismos se encuentran en sus aceites esenciales que resultan de la
mezcla de diferentes compuesto volátiles (García y Herrera, 2007).
El ajo es una planta que se conoce desde hace 3,000 años y cuyo cultivo se
remonta a los tiempos babilónicos (Domingo y López, 2003). Su nombre científico
es “Allium sativum” y es una planta originaria de Asia, desde donde pasó al resto
de Europa y a América (Capó, 2005). Su término en inglés “garlic” deriva de
raíces anglosajonas que significan de manera literal “planta lanza”, refiriéndose a
la forma de sus hojas (Ganado, 2001). Es una raíz bulbosa conformada por varios
segmentos denominados dientes. Su cultivo es rápido y sencillo en clima templado
y florece en primavera y verano (Capó, 2005).
7
Entre sus constituyentes pueden encontrarse carbohidratos, aminoácidos y
proteínas, al igual que fósforo, potasio, azufre y zinc en niveles altos; y selenio,
vitamina C, vitamina D, calcio, magnesio, sodio y hierro en niveles más bajos
(Florencia, 2011). El ajo contiene 33 compuestos sulfurados como la aliina, alicina,
alixina, ajoene, entre otros (Ganado, 2001) (Figura 1), que son los que forma la
planta al reducir y asimilar el azufre que capta por medio de sus raíces, dándole su
sabor y olor característico (Florencia, 2011). La alicina es una sustancia que se
forma al machacar el ajo, debido a la acción de la enzima alinasa (localizada en la
membrana celular) sobre la aliina (Domingo y López, 2003).
Figura 1. Compuestos sulfurados del ajo (Ganado, 2001)
8
Las propiedades medicinales del ajo se conocen desde la antigüedad. Los
chinos lo utilizaban como condimento y lo consumían para combatir infecciones de
diversa índole (Florencia, 2011). Los egipcios también lo incluían en su
alimentación porque creían que les aportaba energía para la construcción de sus
templos y pirámides. Ellos consideraban que el ajo era como una deidad y
recomendaban su consumo para el tratamiento de dolores de cabeza, parásitos e
infecciones (Ganado, 2001); así como elemento de trueque y en el proceso de
momificación de sus muertos (Florencia, 2011). Más tarde, en Roma y Grecia,
comenzó a utilizarse como alimento energetizante y para contrarrestar la fiebre y
desnutrición, además de ser considerado un afrodisíaco. Su uso también se
remonta a la época medieval donde era utilizado con fines esotéricos para la
protección contra brujas, vampiros y fantasmas (Ganado, 2001), razón por la cual
su cultivo se realizaba incluso en los monasterios (Florencia, 2011).
Durante el renacimiento, se tenía consciencia de los efectos medicinales del
ajo y se promovió su cultivo en diferentes ciudades de Italia. En Inglaterra se usó
como analgésico para el dolor dental y para atender infecciones respiratorias. De
igual modo, durante la II Guerra Mundial, los soldados contaban con raciones de
ajo para el tratamiento de sus heridas y la gangrena (Florencia, 2011).
Fue en el año de 1858 cuando Pasteur comenzó a hablar de las
propiedades antibacterianas del ajo. Su aceite volátil protege al intestino del riesgo
de infecciones y contra la formación de bacterias, debido a que el extracto altera el
perfil lipídico de la membrana celular bacteriana (Ganado, 2001). Se ha reportado
9
que tiene actividad inhibitoria sobre varias bacterias gram positivas y gram
negativas, entre las que se incluyen Micrococcus spp, Enterobacter spp,
Escherichia coli , Lactobacillus spp, Pseudomona spp, Klebsiellas spp, Shigella y
Proteus spp (Fani et al., 2007) y hace muy poco, se estudió el efecto bactericida
que tiene sobre Campylobacter jejuni, el cual incrementa conforme se agrega más
cantidad de concentrado (Xiaonan et al., 2011), así como la eficacia que posee
para reducir la presencia de bacterias salivales causantes de infecciones orales
(Borjan et al., 2012). También se ha comprobado que tiene actividad contra virus,
hongos y parásitos (García y Herrera, 2007), reduce los niveles de azúcar,
colesterol y triglicéridos de la sangre, favorece la coagulación sanguínea, protege
al hígado de daño hepático y reduce la incidencia de cáncer (Ganado, 2001)
Por su parte, la cebolla, cuyo nombre científico es Allium cepa es una planta
con hojas cuya longitud puede llegar a medir hasta un metro, está conformada por
un solo bulbo subterráneo que posee raíces poco profundas (Anónimo, 2007).
Contiene proteínas, calcio y flavonoides (Sampath Kumar et al., 2010), así como
compuestos sulfurados, principalmente el disulfuro de alilpropilo, que le confiere
sus propiedades medicinales (Sun- Ho et al., 2011). El olor penetrante que la
caracteriza se debe a estos compuestos y puede percibirse cuando la cebolla es
cortada, debido a la acción que ejercen las enzimas sobre los aminoácidos
(Sampath Kumar et al., 2010).
En la antigua China, era utilizada para controlar la fiebre, los dolores de
cabeza
y
padecimientos
comunes
como
diarreas
y
cólera.
Diversas
10
investigaciones han revelado que, al igual que el ajo, reduce los niveles de
colesterol y azúcar en la sangre (Morales, 1999). También, se usa para reducir
infecciones orales, combatir las infecciones urinarias, anemias y trastornos
cardiovasculares, tratamiento para el acné, impulsar el deseo sexual y prevenir el
cáncer (Sampath Kumar et al., 2010).
Sin embargo, se tienen pocos reportes sobre la actividad bactericida de la
cebolla (García y Herrera, 2007). Se han realizaron estudios sobre el efecto que
posee frente a bacterias que causan descomposición en alimentos como
Pseudomonas fragis y Lactobacillus pentosus y los resultados mostraron una
capacidad inhibitoria mucho menor a comparación con el ajo (Morales, 1999). A
pesar de ello, existen autores que dicen haber comprobado por medio de técnicas
in vitro que la cebolla tiene resultados contra Escherichia coli, Bacillus cereus,
Salmonella spp, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus y que incluso,
tienen mayor efecto inhibitorio que el ajo, por lo que la proponen como una
importante fuente microbicida (García y Herrera, 2007).
Bajo los lineamientos de la Food and Drug Administration (FDA), el ajo y la
cebolla, así como sus derivados, aceites y extractos, son considerados alimentos
GRAS (General Recognized as safe) siempre y cuando no excedan con los
niveles estipulados (GPO, 2013). Lo que determina la GRAS es que cualquier
sustancia que se agrega a los alimentos es considerada un aditivo, y que éstos
deben pasar por la aprobación de los expertos mediante técnicas de laboratorio
para ser considerados seguros para el consumo (FDA, S/F)
11
Las enfermedades causadas por enterobacterias tienen una distribución
mundial y producen pérdidas económicas a los sistemas de producción pecuaria.
Algunos microorganismos como la Escherichia coli forma parte de la flora intestinal
normal de muchos animales, incluido el hombre, pero si se disemina a otros
tejidos, adopta un carácter patógeno y produce serias infecciones (Brooks et al,
2005). En las aves, Escherichia coli es una bacteria que puede asociarse a otras
enfermedades al agravar su cuadro clínico, pero si se presentan condiciones de
tensión o inmunodepresión, es un agente capaz de producir enfermedades como
infección del saco vitelino, aerosaculitis, salpingitis, colisepticemia o diseminación
por medio de la irrigación sanguínea que conlleva a secuelas de artritis e
inflamación del ojo (Mosqueda y Lucio, 1985).
En cambio otras, como la Salmonella spp, no son consideradas parte de la
flora normal y produce graves infecciones sistémicas en la mayoría de los
animales domésticos, pues es una de las principales causas de trastornos
entéricos en el hombre (Flores, S/F). Las infecciones por Salmonella spp son
transmitidas de manera horizontal, pero algunas también pueden transmitirse de
forma vertical a través de los huevos y producir enfermedades persistentes
(Dufour-Zavala et al., 2008).
Salmonella entérica tiene cerca de 2500 serotipos y diferentes hospederos,
por lo que tiene un alto rango de colonización y causa enfermedades sistémicas
graves. Uno de los serotipos mas predominantes capaz de causar enfermedades
gastrointestinales en humanos es la Salmonella enteritidis, la cual puede infectar a
12
ratones, aves y al hombre (Blondel et al., 2010). En la producción avícola, la
paratifoidea causada por Salmonella enteritidis deriva en forma ocasional en alta
mortalidad de las aves jóvenes (Dufour-Zavala et al., 2008). Produce infecciones
subclínicas en las parvadas y las gallinas que quedan como portadoras y que
pueden producir huevos contaminados con la bacteria (Blondel et al, 2010).
Los animales enfermos excretan las bacterias en
heces y orina,
propiciando su diseminación y los animales susceptibles se contagian al ingerir
agua o alimentos contaminados. La infección en el hombre ocurre por ingestión de
alimentos contaminados o al ingerir carne mal cocida de animales contagiados
(Flores S/F). Además, las especies de Salmonella spp y Escherichia coli pueden
llegar a sobrevivir semanas enteras en superficies y en ropa contaminada (Paez y
Ocampo, 2005).
La actividad que presentan los extractos de la cebolla y el ajo sobre la
Escherichia coli y la Salmonella spp son aún objeto de investigación. Algunos
estudios han evaluado los efectos antibacteriales del ajo y la cebolla, para
determinar la Concentración Mínima Inhibitoria requerida para estas bacterias en
condiciones in vitro. En un estudio donde se utilizaron concentraciones al 0.5, 1,
2.5, 5, 10 y 20% de extractos de ajo y cebolla que se agregaron a cultivos en
placas, se determinó que la concentración mínima de ajo requerido para inhibir el
crecimiento de la Eschericha coli es del 5% y que, por el contrario, estas
concentraciones son ineficaces en el caso de la cebolla (Ziarlarimi et al., 2011). En
otra prueba donde se utilizó el extracto de cebolla para determinar su efecto
13
antimicrobiano frente a microorganismos resistentes, se observó que el jugo de
cebolla en concentraciones del 100 y 50% era capaz de evitar el crecimiento de la
Escherichia coli y que en cambio, una concentración del 20 y 10% inhibía
débilmente el crecimiento de la bacteria, al compararla con las placas control (Al
Masaudi y Al Bureikan, 2012).
Otro aporte científico informa que se necesitan concentraciones de al
menos 500mg/0.5 ml de ajo para mostrar efectos inhibitorios sobra la Salmonella
spp y la Escherichia coli, mientras que la cebolla no demuestra tener resultados
significativos (Alwazni y Drwesh, s/f).
En otra investigación, se evaluaron los
efectos antimicrobianos que poseen los extractos de cebolla y de ajo frente a
bacterias aisladas en la industria alimentaria, entre las que también se encuentran
la Escherichia coli y la Salmonella spp, dando como resultados que el extracto de
cebolla posee una mayor actividad antimicrobiana y que presenta un mayor halo
de inhibición en el análisis en placa, lo que contrasta con los otros aportes que
avalan el mejor efecto bactericida del ajo (García y Herrera, 2007).
14
3. JUSTIFICACIÓN
Según la OMS, un desinfectante es aquel agente que es capaz de inhibir el
crecimiento de un microorganismo o de destruirlo, siempre que no se trate de una
bacteria en su fase esporulada; sin embargo, la acción de un desinfectante no
conlleva la total destrucción de los microorganismos de una superficie, aunque sí
los reduce a cantidades mínimas que no dañen la salud (OMS, 2004).
La resistencia adquirida a los antibióticos que presentan algunas bacterias,
es un problema tanto en la medicina veterinaria como en la salud humana. Aunque
muchas Gram positivas son aún susceptibles a los antimicrobianos, varias
enterobacterias han desarrollado resistencia (Biberstein y Zee, 1994). Algunas
bacterias como Escherichia coli han llegado a causar enfermedades que luego no
se pueden controlar en las comunidades, por lo que es necesario probar nuevos
agentes bacterianos cuyo efecto de duración sea el óptimo. Es por ello que se
comenzó a hacer uso de productos herbales que proporcionaran una respuesta a
la resistencia bacteriana (Rahman et al., 2011).
El uso de la herbolaria brinda varias ventajas en el ámbito de los
antimicrobianos, al tener acceso a productos naturales que por lo regular se
encuentran en el mercado y significa un ahorro para muchos productores, como
los del traspatio, quienes no cuentan con los recursos necesarios para invertir en
grandes cantidades de antimicrobianos y desinfectantes que garanticen la sanidad
15
de su explotación y que incluso, muchas veces se encuentran en zonas
marginadas de difícil acceso.
Por lo anterior, se planteó el siguiente trabajo de investigación para evaluar
la capacidad antimicrobiana de dos especies de la familia de las liliáceas que
pueden encontrarse con facilidad en el mercado y que pueden ser buenos
elementos para una desinfección más viable y económica de áreas insalubres.
16
4. HIPÓTESIS
Las diferentes concentraciones de ajo y cebolla determinan el efecto
antimicrobiano que poseen éstos frente a la Escherichia coli y Salmonella
enteritidis.
5. OBJETIVO GENERAL

Determinar las concentraciones en las que el ajo y la cebolla presentan
efecto antimicrobiano ante Escherichia coli y Salmonella enteritidis.
6. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria de distintas suspensiones
de ajo y cebolla.

Determinar si los extractos de ajo y cebolla ejercen un efecto bactericida
frente a la Escherichia coli y Salmonella enteritidis.
17
7. MATERIAL Y MÉTODOS
7.1 LOCALIZACIÓN
El presente trabajo se realizó en las instalaciones del Laboratorio Cordobés de
Diagnóstico Pecuario que se encuentra en la ciudad de Córdoba, Veracruz con
domicilio en Av. Las Quintas S/N Fraccionamiento las Quintas.
7.2 MATERIAL BIOLÓGICO:
-
Cultivos de Escherichia coli
-
Cultivos de Salmonella enteritidis
7.3 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN PARA LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA
INHIBITORIA
Los productos naturales que se evaluaron fueron el ajo y la cebolla, los cuales se
obtuvieron en el mercado de la ciudad de Córdoba, Veracruz en presentaciones
en fresco y deshidratado. Se obtuvo una muestra de ajo en fresco y otra
deshidratada en presentación comercial. Éstas fueron identificadas como: Ajo
fresco (Af) y Ajo deshidratado (Ad)
En el caso de la cebolla, se obtuvieron muestras en fresco y una
deshidratada en presentación comercial. Éstas fueron identificadas como cebolla
blanca (Cb), cebolla cambray (Cc), cebolla morada (Cm) y cebolla deshidratada
(Cd).
18
7.4 INGREDIENTES FRESCOS
Para el extracto acuoso:

Los ingredientes frescos se pelaron y después se pesaron 20 g en una
balanza granataria.


Se maceró la muestra en un mortero con pistilo
Se adicionaron 180 ml de agua destilada para hacer una suspensión al 10%
En un embudo se colocó una gasa extendida y se filtró para eliminar
impurezas.
Todas las soluciones fueron colocadas en un recipiente estéril y luego se
conservaron a 5ºC + 1ºC para evitar el crecimiento de otras bacterias que
pudieran influir en los resultados.
A partir de cada una de las soluciones obtenidas, se hicieron 23 diluciones
decuples seriadas en micro placas de 96 pozos con fondo en “U” en un volumen
de 50µl de caldo soya Tripticaseina (TSB por sus siglas en ingles). A continuación,
se agregó a cada uno de los 50µl de TSB a una concentración de 5x10 -2- de la
escala de Macfarland de una cepa de Salmonella enteritidis, tipificada por el
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE).
El mismo
procedimiento anterior se realizó con cepas control de Escherichia coli.
Mediante la técnica se comprobó la Concentración mínima Inhibitoria (CMI)
del extracto de ajo y cebolla contra Salmonella enteritidis y Escherichia coli. La
19
CMI es la cantidad más baja que impide el crecimiento de los microorganismos
(Ryan y Ray, 2005). Los datos se agruparon en una tabla para realizar un análisis
cualitativo, al considerar las variables “positivo” y “negativo” en dependencia de la
presencia de turbidez en los pozos. Se interpretó como CMI aquella que
corresponda a la dilución con menor concentración de la solución de ajo donde no
existe turbidez por falta de crecimiento bacteriano.
7.5 DISEÑO DE INVESTIGACIÓN PARA DETERMINACIÓN DE PORCENTAJE
DE ELIMINACIÓN
Se prepararon las suspensiones de ajo y cebolla del mismo modo en que se
realizaron para la investigación anterior, pero se realizan tres diferentes tipos de
diluciones en frascos estériles, al utilizar para ello una que se encuentre al 20%
(2x), otra al 10% (1x) y otra al 5% (0.5x).
Se realizaron los inóculos de las bacterias a utilizar, al tomar asadas de las
mismas de las placas de cultivo correspondientes y colocándolas en tubos con 10
ml de Infusión Cerebro Corazón (ICC) e incubadas a 37º C durante 24 horas.
Después se nivelaron a una cuenta viable 1X10-8 UFC/ml. Posteriormente, se
tomaron una serie de tres tubos para cada uno de los microorganismos a utilizar y
se agregaron 9 ml de las tres diferentes concentraciones de la suspensión para
adicionarles 1 ml de la suspensión microbiana. Se agitaron y se dejaron en reposo
durante 5 minutos en el caso de las bacterias y 15 minutos en el caso de hongos.
20
Una vez transcurrido el tiempo, se depositaron 0.1 ml y 0.01 ml en cajas de
petri y se les agregó el medio de cultivo correspondiente. En caso de Salmonella
enteritidis se agregó verde brillante y para Escherichia coli se utilizó agar
McConkey. Después de agregar el medio, se homogenizó con movimientos
circulares y se incubó a 37oC durante 24 horas.
El crecimiento en las placas y el conteo de UFC se determinó a partir de las
placas de control positivo que se realizaron mediante diluciones seriadas en 10
tubos con 9 ml de agua destilada y 1 ml de inóculo inicial. Se contaron las colonias
desarrolladas y se realizaron las conversiones pertinentes al utilizar la siguiente
fórmula:
% Eliminación =100 - Log 10 UFC sobrevivientes X 100
Log 10 UFC control (+)
7.6 ESTANDARIZACIÓN DE LA MUESTRA
Para el trabajo con los productos deshidratados, se realizaron técnicas de
estandarización de la concentración idónea para la investigación. Se utilizaron
muestras de ajo y cebolla deshidratados al 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15% y 30% en
10 ml de agua. Se realizaron 3 juegos de los 7 tubos para cada producto (Figura
2), para ser medidos mediante espectrofotómetro en diferentes lapsos de tiempo,
comprendidos hasta las 48 horas como máximo.
21
Figura 2. Suspensiones de ajo deshidratado.
En el caso de los productos frescos, se maceraron los trozos en un mortero
con pistilo y se trabajó con concentraciones del 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15% y
30% en 10 ml de agua destilada, los cuales se dividieron en tres grupos para filtrar
en diferentes tiempos. Al igual que los productos deshidratados, se utilizó el
espectrofotómetro para medir el nivel de Absorbancia (ABS).
Las lecturas con el espectrofotómetro se realizaron para tener una mejor
relación del producto y el agua para las diferentes suspensiones que se utilizaron
en el estudio. Los rangos manejados para la lectura convergen entre los 500 y 625
nm, debido a que el nivel de absorción del color amarillo se encuentra entre estos
valores. Con la absorbancia se puede conocer la concentración de luz que es
absorbida en una muestra (Abril et al., S/F).
22
8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se filtraron los primeros 7 tubos con ajo deshidratado en diferentes
concentraciones para medir las Absorbancias (ABS) que tienen las muestras el
mismo día de su preparación. Las medidas fluctúan entre 550 y 625 nm, que están
representadas con las líneas de colores. En la figura 3, se puede observar que la
ABS tiene un aumento lineal conforme se incrementa la concentración de ajo
deshidratado, donde la concentración del 10% es la que posee los niveles más
altos en los cuatro valores de medidas de nm utilizados.
ABS
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
550
575
600
625
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Concentración
Figura 3. Absorbancia en nm del ajo deshidratado filtrado el mismo día
Pasadas 24 horas, se filtraron y midieron las ABS del otro grupo de
muestras de ajo deshidratado. En la figura 4 se observa que las gráficas
comenzaron a presentar variaciones, al comenzar a disminuir la ABS en todas las
concentraciones, al ser más evidente en aquellas menores al 7%. Al observar la
muestra, se pudo percibir un ligero cambio de turbidez, así como disminución del
olor a ajo que la caracterizaba.
23
1.6
ABS
1.4
1.2
1
550
0.8
575
0.6
600
0.4
625
0.2
0
0%
2%
4%
6%
8%
10% Concentración
12%
Figura 4: Absorbancia en nm del ajo deshidratado filtrado a las 24 horas
Después de 48 horas, se filtró el último grupo de muestras de ajo
deshidratado. En esta ocasión puede observarse que los niveles de ABS
continuaron en disminución en aquellas muestras que poseían concentraciones
inferiores al 7 %. El aroma característico a ajo podía percibirse en forma leve y la
muestra se veía más turbia que las anteriores debido a la degradación de
compuestos (Figura 5).
ABS
1.8
1.6
1.4
1.2
550
1
575
0.8
0.6
600
0.4
625
0.2
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Concentración
Figura 5. Absorbancia en nm del ajo deshidratado filtrado a las 48 horas
24
Los mismos criterios fueron utilizados en los tubos con las diferentes
concentraciones de cebolla deshidratada. Se midió la ABS del grupo de muestras
filtradas el mismo día de su preparación y se pudo observar que, al contrario que
el ajo, los valores de ABS de la cebolla aumentaban de manera lineal en las
concentraciones del 1 al 5 %, pero presentó disminución en aquellas
concentraciones mayores a éstas. El mejor nivel de ABS se obtuvo a una
concentración del 5% (Figura 6).
ABS
0.7
0.6
0.5
550
0.4
575
0.3
600
0.2
625
0.1
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
Concentración
12%
Figura 6. Absorbancia en nm de la cebolla deshidratada leída mismo día
Pasadas las 24 horas, se filtró el otro grupo de muestras. Los valores
disminuyeron en todas las concentraciones; sin embargo, se mantuvo el 5% como
aquella en la que se presentaban los mejores niveles de ABS (Figura 7).
25
ABS
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
550
0.25
575
0.2
600
0.15
625
0.1
0.05
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Concentración
Figura 7. Absorbancia en nm de la cebolla deshidratada leída a las 24 horas
Al cabo de las 48 horas se filtró el último grupo de muestras. En la figura 8,
se observa que los niveles de ABS presentan un decremento lineal, donde la
concentración al 10% fue la que presentó los mejores niveles de ABS de la luz. Al
igual que lo sucedido con las suspensiones de ajo deshidratado, se fue perdiendo
el olor a cebolla que se percibió al inicio de la preparación de la muestra, así como
pudo observarse inicio de turbidez debido a la degradación del producto.
ABS
0.4
0.35
0.3
0.25
550
0.2
575
0.15
600
0.1
625
0.05
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
Concentración
12%
Figura 8. Absorbancia en nm de la cebolla deshidratada leída a las 48 horas
26
Tras filtrar las suspensiones con ajo fresco el mismo día en que se
prepararon y someterlas al espectrofotómetro, se pudo observar que los niveles de
ABS tenían un aumento lineal conforme aumentaba la concentración del producto,
donde la concentración de 10% fue la que presentó los mejores resultados de ABS
(Figura 9).
ABS
0.4
0.35
0.3
0.25
550
0.2
575
0.15
600
0.1
625
0.05
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
Concentración
12%
Figura 9. Absorbancia en nm del ajo fresco filtrado mismo día
Tras esperar 24 horas se filtró el otro grupo de suspensiones con el
producto fresco y se tomaron las medidas de la ABS de las diferentes
concentraciones. En esta ocasión se pudo observar que los niveles de ABS
aumentaban con el tiempo de reposo, al mantener la concentración al 10% como
la que presentaba aún la mejor ABS. El olor a ajo podía percibirse todavía y las
suspensiones no presentaban turbidez (Figura 10).
27
ABS
0.4
0.35
0.3
0.25
550
0.2
575
0.15
600
0.1
625
0.05
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Concentración
Figura 10. Absorbancia en nm del Ajo fresco filtrado 24 horas
Transcurridas 48 horas se filtró el otro grupo de suspensiones de ajo fresco
y las medidas de ABS revelaron que éstas mantienen un crecimiento lineal, donde
la concentración al 10% fue la que tenía los mejores resultados. Sin embargo,
podía observarse que en las concentraciones menores al 5% hubo decremento en
los niveles de ABS. Aún si se podía percibir el olor característico del ajo, los tubos
presentaron una ligera turbidez (Figura 11).
ABS
0.4
0.35
0.3
0.25
550
0.2
575
0.15
600
0.1
625
0.05
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
Concentración
12%
Figura 11. Absorbancia en nm del Ajo fresco filtrado 48 horas
28
Al igual que con el ajo, se procedió a realizar suspensiones con cebolla
fresca y se clasificaron los tubos por grupos. El primer grupo fue filtrado el mismo
día de su preparación y después de sometió a la lectura por espectrofotómetro.
Los resultados revelaron que la ABS aumentaba conforme incrementaba la
concentración de cebolla en el agua, aunque no lo hacía de una manera lineal. La
concentración al 10% fue la que arrojó los mejores niveles de ABS, mientras que
las de 5% y 7% tenían resultados parecidos (Figura 12).
0.2
ABS
0.18
0.16
0.14
0.12
550
0.1
575
0.08
600
0.06
625
0.04
0.02
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
12%
Concentración
Figura 12. Absorbancia en nm de la Cebolla fresca filtrada el mismo día
Al cabo de 24 horas, se filtró el siguiente grupo de muestras y tras medirse
con el espectrofotómetro, se pudo observar que la ABS decrecía en las
suspensiones con concentraciones menores o iguales al 5%, mientras que en las
mayores al 7% comenzaban a aumentar los niveles (Figura 13).
29
0.25
ABS
0.2
0.15
550
575
0.1
600
625
0.05
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
Concentración
12%
Figura 13. Absorbancia en nm de la cebolla fresca filtrada a las 24 horas
Sin embargo, tras realizar la filtración y la lectura a las 48 horas, se pudo
observar que la ABS comenzaba a variar de nueva cuenta, al descender en todos
los niveles medidos. Aún si las concentraciones del 7% y 10% mantenían niveles
más altos que los demás, las concentraciones menores al 5 % presentaban
degradación, hecho que también pudo constatarse en el cambio de olor de la
suspensión (Figura 14).
0.14
ABS
0.12
0.1
550
0.08
575
0.06
600
0.04
625
0.02
0
0%
2%
4%
6%
8%
10%
Concentración
12%
Figura 14. Absorbancia en nm de la Cebolla fresca filtrada a las 48 horas
30
Se
observó que si se realiza la suspensión con los productos
deshidratados y se deja reposar por más de 48 horas, el olor característico de los
compuestos sulfurados se pierde y comienza a presentarse turbidez en la
suspensión. Con el análisis en el espectrofotómetro también se pudo observar que
los límites de ABS de la luz decrecen de manera gradual con el paso del tiempo, lo
que sugiere que hay degradación de los compuestos que conforman el producto.
Esto representa un problema para aquellas personas que piensen utilizar este tipo
de suspensiones como desinfectantes, ya que significaría que no se puede
almacenar por más de 48 horas y que su uso tendría que hacerse dentro de las
primeras 24 horas de elaboración, razón por la cual se descartó para fines de la
investigación. Con los datos leídos mediante espectrofotómetro se determinó
trabajar con concentraciones del 10% debido a que éstas mostraron menor
variación en los gráficos, a comparación de aquellas con concentraciones
menores en los que decrecía su ABS.
Para el análisis en microplaca (Figura 15) se realizaron suspensiones de
Af, Cb, Cc y Cm. Se decidió trabajar con Cc y Cm para comprobar si existía
alguna variación de los resultados en diferentes variedades de cebollas.
31
Figura 15. Pozos de una microplaca utilizada para observar la CMI, la
cual fue determinada mediante la presencia o ausencia de turbidez
En contraste con los resultados que obtuvieron García y Herrera (2001) en
su investigación de la inhibición que poseen tres especies Allium sobre cinco
diferentes cepas bacterianas, en donde también se incluyen Escherichia coli y
Salmonella spp., los resultados observados en este estudio indican que la cebolla
no fue efectiva en ninguna de las tres muestras evaluadas, ya que todos los pozos
presentaban turbidez a las 24 hrs .
Para la representación en tablas se tomaron en consideración los primeros
diez pozos debido a que son los que se encuentran dentro de los rangos de
inhibición. El resto de los pozos del total de 96 que conforman la microplaca,
fueron positivos y presentaban turbidez. Fueron marcados como negativos
aquellos pocillos con ausencia de turbidez (Cuadros 1 a 3).
32
Cuadro 1. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia
coli a una suspensión de cebolla (Allium cepa) blanca al 10%
POCILLOS
CEPAS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Salmonella enteritidis
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Escherichia coli
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Cuadro 2. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia
coli a una suspensión de cebolla (Allium cepa) morada al 10%
POCILLOS
CEPAS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Salmonella enteritidis
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Escherichia coli
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
33
Cuadro 3. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia
coli a una suspensión de cebolla (Allium cepa) cambray al 10%
POCILLOS
CEPAS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Salmonella enteritidis
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Escherichia coli
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Contrario a lo obtenido en este estudio, García y Herrera (2001) mencionan
que el ajo no presentó resultados tan favorables en su investigación, debido a que
no tuvo efecto alguno sobre las cepas de Salmonella spp y que además, la
capacidad inhibitoria que tiene sobre Escherichia coli es menor que la que
presenta la cebolla.
En el Cuadro 4, se puede observar que el ajo presentó inhibición en los
primeros pozos de la microplaca de todas las bacterias estudiadas, donde
Escherichia coli demostró los mejores resultados. Los datos obtenidos sobre
Escherichia coli coinciden con los resultados citados por Morales (1999), en donde
menciona que las suspensiones con concentraciones iguales o superiores al 3%
de ajo presentan efecto inhibitorio sobre esta bacteria.
34
Cuadro 4. Patrón de sensibilidad de Salmonella enteritidis y Escherichia coli a una
suspensión de ajo (Allium sativum) al 10%
POCILLOS
CEPAS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Salmonella enteritidis
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
Escherichia coli
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
Debido a que el ajo demostró resultados positivos de inhibición en la
microplaca, se calcularon las cantidades mínimas del producto necesarias para
obtener un efecto inhibitorio sobre las bacterias utilizadas. En el cuadro 5, se
observa que la cantidad de ajo necesaria para inhibir el crecimiento
de
Escherichia coli fue de 12.5 mg/ml, en tanto que para Salmonella enteritidis fue de
25 mg/ml. Estos datos distan de los proporcionados por Alwazni y Drewsh (s/f),
quienes concluyeron que la CMI inhibitoria del ajo sobre las bacterias antes
mencionadas es de al menos 500 mg/0.5 ml.
35
Cuadro 5.- CMI del ajo necesaria contra las bacterias de la investigación
BACTERIA
Cantidad de ajo requerida para inhibir
crecimiento de microorganismos
Salmonella enteritidis
25 mg/ml
Escherichia coli
12.5 mg/ml
Después de obtener la CMI de los extractos de ajo y cebolla, se procedió a
determinar la tasa (%) de eliminación que tienen dichas suspensiones sobre
placas con medio enriquecido para cada bacteria. Para esta nueva etapa del
trabajo, sólo se utilizaron muestras de ajo fresco y cebolla blanca para tener un
rango comparativo. La razón por la que se continuó con el trabajo de la cebolla
blanca y se descartaron las variedades cambray y morada fue porque no
presentaron ningún efecto de inhibición en la microplaca..
Para realizar las pruebas de tasa (%) de eliminación se prepararon las
placas que sirvieron como control positivo para comprobar que existiera efecto
bactericida sobre las cepas bacterianas. (Figura 16 y 17)
36
Figura 16. Control positivo de diluciones seriadas del
uno al tres, donde puede observarse crecimiento de
cepas de Escherichia coli en Agar McConkey
Figura 17. Control positivo de diluciones seriadas del uno
al tres donde puede observarse crecimiento de colonias
de Salmonella enteritidis en Agar Verde Brillante
El control positivo dio como datos que los inóculos bacterianos tenían
12,000 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de Escherichia coli y 270,000
UFC de Salmonella enteritidis. Al obtener el conteo de las placas de control
positivo, se compararon los resultados obtenidos de la prueba de determinación
37
de porcentaje de eliminación. Para ello, se prepararon suspensiones de ajo y
cebolla al 20% (2x), 10% (1x) y 5% (0.5 X) y se agregaron alícuotas en cajas de
petri a las que se después se les agregó un medio de enriquecimiento que
favoreciera el crecimiento de las bacterias. Las placas se dejaron incubar durante
24 horas a una temperatura de 37oC y luego se realizó el conteo de UFC para
compararlas con el control positivo.
En el cuadro 6 se mencionan la cantidad de UFC de las tres diferentes
cepas bacterianas observadas en las placas. La suspensión con ajo al 20%
permitió el crecimiento de 130 UFC de Escherichia coli, mientras que en las placas
de Salmonella enteritidis evitó el crecimiento de la bacteria. Por su parte, la cebolla
al 20% permitió el crecimiento de 30 UFC de Escherichia coli y Salmonella
enteritidis. Al compararlos con las placas del control positivo, los resultados
también son similares a lo que expresan Zirlarimi et al. (2011), quienes aseguran
que la CMI del ajo es del 5% y que la cebolla requiere concentraciones del 10 y
20% para ejercer un efecto inhibitorio sobre las bacterias.
38
Cuadro 6. Relación de UFC observadas en las placas de Escherichia coli y
Salmonella enteritidis, después de realizar la técnica para la tasa (%) de
eliminación
Escherichia
Salmonella
coli
enteritidis
UFC
UFC
Ajo 2x
130
0
Ajo 1X
740
0
Ajo 0.5 X
2,000
0
Cebolla 2x
30
30
Cebolla 1X
110
100
Cebolla 0.5 X
640
2,810
Control positivo
12,000
270,000
En el cuadro 7 se observa que las mayores concentraciones de ajo eliminan
Escherichia coli en 48.7% y la Salmonella enteritidis en 100%, en tanto que la
mayores concentraciones de cebolla, observaron tener efecto de eliminación de
63.78% para Escherichia coli y menor eliminación para Salmonella enteritidis
(72.80%) en relación con el ajo. Esta etapa de la investigación corrobora lo
descrito por Herrera y García (2001) de que la cebolla tiene mejor efecto
bactericida sobre la Escherichia coli.
39
Cuadro 7.- Tasa (%) de eliminación de los extractos de ajo y cebolla sobre
las bacterias de Escherichia coli y Salmonella enteritidis
% sobre
% sobre
Escherichia
Salmonella
coli
enteritidis
Ajo 2x
48.17
100
Ajo 1x
29.66
100
Ajo 0.5 x
19.07
100
Cebolla 2x
63.78
72.80
Cebolla 1x
49.95
63.17
Cebolla 0.5 x
31.20
36.50
40
9. CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos durante este estudio demuestran que los principios
activos del ajo a niveles de 10% pueden ser usados como desinfectante natural
para la inhibición de Escherichia coli y Salmonella enteritidis. En el caso de la
cebolla, es posible que los efectos obtenidos para la inhibición en el crecimiento
de los microorganismos en las microplacas, no hayan sido los adecuados por las
concentraciones utilizadas, como pudo comprobarse con la técnica de tasa (%) de
eliminación. Es probable que se requieran concentraciones de al menos el 20%
para observar el efecto antimicrobiano deseado. Se sugiere una evaluación en
aves de traspatio con la finalidad de observar el efecto en los parámetros
productivos que tienen este tipo de aves bajo manejos rustico, ya que el efecto
mostrado puede ser una buena alternativa tecnológica para mejorar la viabilidad
de las aves.
41
10. LITERATURA CITADA
1.- Abril N, Bárcena J, Fernández E, Galván A, Jorrín J, Peinado J, Meléndez F,
Túnez I
s/f. Espectrofometría:
colorimétrica
de
Espectros de
Absorción y cuantificación
biomoléculas.
Disponible
en
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf consultada el 15 de octubre
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